Was ist eine Polymerasekettenreaktion (pcr)? Fakten über Test, Schritte & verwendet für

Was ist PCR (Polymerasekettenreaktion)?

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Technik, mit der Spurenmengen von DNA (und in einigen Fällen RNA) amplifiziert werden, die sich in oder auf nahezu jeder Flüssigkeit oder Oberfläche befinden, auf der DNA-Stränge abgelagert werden können. Der Schlüssel zum Verständnis der PCR besteht darin, zu wissen, dass jeder Mensch, jedes Tier, jede Pflanze, jeder Parasit, jedes Bakterium oder jedes Virus genetisches Material wie DNA- (oder RNA-) Sequenzen (Nukleotidsequenzen oder DNA- oder RNA-Stücke) enthält, die für ihre Art einzigartig sind. und an das einzelne Mitglied dieser Art. Wenn eine Probe DNA- oder RNA-Abschnitte enthält, ist die PCR eine Methode, mit der diese eindeutigen Sequenzen amplifiziert (und mit der mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit die Identität der Quelle bestimmt werden kann (a spezifische Person, Tier oder pathogener Organismus) der in oder auf fast jeder Materialprobe gefundenen DNA- oder RNA-Spur.

Die PCR-Amplifikation ist jedoch nur ein Teil des Identifizierungstests. Sobald die Amplifikation erfolgt ist (siehe unten), müssen die amplifizierten Segmente mit anderen Nukleotidsegmenten aus einer bekannten Quelle (zum Beispiel einer bestimmten Person, einem Tier oder einem pathogenen Organismus) verglichen werden. Dieser Vergleich einzelner Segmente wird häufig durchgeführt, indem PCR-generierte Nukleotidsequenzen neben bekannten Nukleotidsequenzen von Menschen, Krankheitserregern oder anderen Quellen in einem Trenngel platziert werden. Elektrischer Strom fließt durch das Gel und die verschiedenen Nukleotidsequenzen bilden Banden, die in Bezug auf ihre elektrische Ladung und Molekülgröße einer "Leiter" ähneln. Dies wird als Gelelektrophorese bezeichnet. Banden oder "Leiter" -ähnliche Schritte, die zu den gleichen Niveaus im Gel wandern, zeigen die Identität von Nukleotidsequenzen. Diese Methode ist eine der beliebtesten Methoden zur Durchführung von PCR-Tests (siehe Abb. 1).

1, Banden oder "Leiter" -ähnliche PCR-Schritte produzierte DNA von Mycobacterium (mit freundlicher Genehmigung der CDC)

Zahl. Repetitive Elemente (Rep) -PCR (A) und Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) (B) von Mycobacterium cosmeticum-Isolaten von 2 Patienten in Ohio und 1 Patienten in Venezuela. Rep-PCR wurde unter Verwendung des BOXA1R-Primers (3) durchgeführt, und PFGE wurde mit dem Restriktionsenzym AseI durchgeführt. Die Bahnen 1, 2, Ohio, isolieren OH1 und OH2; Spuren 3, 4, Kontrollstämme ATCC BAA-878T und ATCC BAA-879; Spur 5, venezolanisches Isolat VZ1. DNA-Größenstandards sind 100 bp (S1) und 48, 5 kb Marker (S2).

Wie erfolgt die PCR (Polymerasekettenreaktion)?

1983 fand Kary Mullis die grundlegenden Schritte zur Amplifikation von DNA-Sequenzen heraus. Er und Michael Smith erhielten 1993 den Nobelpreis für die Entwicklung dieses Verfahrens. Es gibt einige grundlegende Schritte, die nacheinander ausgeführt werden. Die PCR kann in einem einzelnen Röhrchen mit geeigneten Chemikalien und einer speziell entwickelten Heizung durchgeführt werden. Folgende Reagenzien oder Chemikalien werden benötigt:

• Eine Probe, die eine Nukleotidsequenz enthält (aus Blut, Haar, Eiter, Hautkratzen usw.)
• DNA-Primer: kurze einzelsträngige DNA, die an Nukleotidsequenzen bindet und die Synthese eines komplementären Nukleotidstrangs fördert
• DNA-Polymerase: Ein Enzym, das, wenn an die DNA ein Primer gebunden ist, über das DNA-Segment DNA-Bausteine ​​zu komplementären Basenpaaren bindet und so einen komplementären DNA-Nukleotidstrang synthetisiert (Einführung einer hitzeresistenten DNA-Polymerase, Taq Polymerase, die von hitzebeständigen Bakterien stammt, verbesserte die Fähigkeit, PCR durchzuführen, deutlich.
• Die Lösung enthält einen großen Überschuss an DNA-Bausteinen, die als Nukleotide bezeichnet werden (Adenin, Thymidin, Cytosin und Guanin, abgekürzt als: A, T, C bzw. G). Wenn diese Blöcke miteinander verbunden sind, bilden sie eine Nukleotidsequenz oder einen einzelnen DNA-Strang. Wenn diese Bausteine ​​ihren komplementären Baustein durch schwache Wasserstoffbrückenbindungen binden (zum Beispiel wird A nur mit T und G nur mit C binden), wird eine komplementäre DNA-Nukleotidsequenz gebildet und an die ursprüngliche einzelsträngige DNA gebunden. Wenn die Bindung abgeschlossen ist, wird eine komplementäre Doppelstrang-DNA in einer spezifischen Sequenz gebildet.

Die PCR beginnt dann mit einem DNA-Abschnitt aus einer Probe, die mit den oben aufgeführten Reagenzien in ein Röhrchen gegeben wird. Die Lösung wird auf mindestens 94 ° C erhitzt; Diese Wärme bricht die Wasserstoffbrücken, die die Bildung komplementärer DNA-Stränge ermöglichen, so dass nur einzelne Stränge im Gemisch vorhanden sind (dies wird als Denaturierung doppelsträngiger DNA bezeichnet).

Die Mischung wird auf etwa 54 ° C (129, 2 ° F) abkühlen gelassen. Bei dieser Temperatur binden die DNA-Primer und die DNA-Polymerase an einzelne einzelsträngige DNA (dies wird als Annealing der DNA bezeichnet). Da die Bausteine ​​im Gemisch zu viel enthalten (hohe Konzentration), werden sie von der Polymerase zur Herstellung neuer komplementärer DNA-Stränge verwendet (als Verlängerung der DNA bezeichnet), und dieser Vorgang verläuft bei 72 ° C schneller. Dieser Prozess erzeugt aus jedem der Einzelstränge des ursprünglichen Moleküls ein neues doppelsträngiges DNA-Molekül.

Dieser Zyklus wird in einer Maschine, die als Thermocycler bezeichnet wird und die Heiz-Kühl-Zyklen automatisch wiederholt, etwa 40 Mal wiederholt, wobei sich die Menge jeder DNA-Sequenz jedes Mal verdoppelt, wenn der Heiz-Kühl-Zyklus abgeschlossen ist. Was ursprünglich ein einzelnes kurzes DNA-Segment war, kann nach 40 Verdopplungszyklen auf etwa 100 Milliarden Kopien amplifiziert werden.

Warum sollte ein Arzt einen PCR-Test (Polymerasekettenreaktion) bestellen?

Der PCR-Test bildet die Grundlage für eine Reihe von Tests, mit denen viele verschiedene medizinische Fragen beantwortet werden können, die Ärzten bei der Diagnose und Behandlung von Patienten helfen. Zum Beispiel können PCR-Tests pathogene Organismen bei Patienten nachweisen und identifizieren, insbesondere solche, die schwierig zu kultivieren sind (zum Beispiel HIV und andere Viren und bestimmte Pilze).

Andere Ärzte bestellen PCR-Tests, um genetische Krankheiten zu diagnostizieren, während andere Ärzte PCR verwenden, um biologische Zusammenhänge zu erkennen, beispielsweise Eltern von Kindern zu identifizieren. PCR-Tests werden auch verwendet, um genetische Mutationen und Umlagerungen bei bestimmten Krebsarten zu identifizieren und zu charakterisieren.

PCR-Tests wurden jedoch modifiziert und auf viele Aspekte wissenschaftlicher Untersuchungen ausgedehnt, darunter Evolutionsbiologie, genetisches Fingerprinting, forensische Untersuchungen und viele andere.

Was ist RT-PCR?

RT-PCR ist ein PCR-Test zum Nachweis und zur Messung von RNA. Obwohl anfängliche PCR-Tests DNA amplifizierten, verwenden viele Viren und andere biologische Komponenten (zum Beispiel Mitochondrien) RNA als genetisches Material. Die RT-PCR unterscheidet sich von der herkömmlichen PCR dadurch, dass zuerst RNA genommen und der RNA-Strang in einen DNA-Strang umgewandelt wird. Dies erfolgt durch im Wesentlichen dasselbe Verfahren für die oben beschriebene PCR, mit der Ausnahme, dass anstelle der DNA-Polymerase ein als reverse Transkriptase bezeichnetes Enzym verwendet wird. Die reverse Transkriptase ermöglicht die Translation eines einzelnen RNA-Strangs in einen komplementären DNA-Strang. Sobald diese Reaktion auftritt, kann das Routine-PCR-Verfahren verwendet werden, um die DNA zu amplifizieren. RT-PCR wurde zum Nachweis und zur Untersuchung vieler RNA-Viren eingesetzt.

RT-PCR sollte nicht mit einer anderen Variante der PCR verwechselt werden, die als Real-Time-PCR bezeichnet wird. Real-Time-PCR ist eine Variante der PCR, mit der die amplifizierte DNA während der üblichen 40 Zyklen des Verfahrens analysiert werden kann. Obwohl das Verfahren der herkömmlichen PCR mit Zyklen ähnelt, werden bei der Echtzeit-PCR fluoreszierende Farbstoffe verwendet, die an einige der Bausteine ​​oder kleinen Nukleotidstränge gebunden sind. Abhängig von der verwendeten Methode tritt Fluoreszenz auf, wenn die amplifizierten DNA-Stränge gebildet werden. Die Fluoreszenzmenge kann während der 40 Zyklen gemessen werden und ermöglicht es den Forschern, bestimmte Produkte und deren Mengen während der Amplifikationszyklen zu messen. Dadurch können Forscher oder Labortechniker häufig die Gelelektrophorese oder andere sekundäre Verfahren, die für die Analyse der PCR-Produkte erforderlich sind, überspringen und so schnellere Ergebnisse erzielen.

Echtzeit-PCR und RT-PCR sind Variationen oder Modifikationen des ursprünglichen PCR-Tests. Es gibt jedoch viel mehr Variationen (mindestens 25), die zur Lösung spezifischer Probleme verwendet werden. Sie haben alle unterschiedliche Namen wie Assembly-PCR, Hot-Start-PCR, Multiplex-PCR, Festphasen-PCR und viele andere.

Die PCR wird wahrscheinlich weiterhin modifiziert, um andere Fragen in Medizin und Biologie zu beantworten. und andere Studienrichtungen.